角蛋白酶

取自 食品百科全书

　　角蛋白酶是一种可专一地降解角蛋白的蛋白酶类，角蛋白酶可由多种微生物产生， 能特异性地降解角蛋白， 在饲料、皮革、医药业、食品等工业及环境治理方面具有广阔的应用前景。

　　发现年代

　　角蛋白酶（keratinase）是一种诱导酶，只有当环境中出现诱导子(角蛋白)时才会合成。

　　早在19世纪初人们就发现一些生物能降解角蛋白，自那时以来分离此类菌株的工作一直在进行。目前发现可降解角蛋白的微生物已有30多种，其中有细菌、放线菌和真菌。细菌中主要是地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，放线菌中主要是高温单胞菌属(Thermmonospora)，真菌中主要是白色假丝酵母和链霉菌(Streptomyces)。不同微生物产生的角蛋白酶具有一定的差异，主要表现在酶的存在方式以及酶的结构、组成、稳定性、最适反应温度、pH值等方面。例如角蛋白酶的存在形式，有的主要存在于胞内，有的主要分泌至胞外，而霉菌的角蛋白酶既可见于胞内又可分泌至胞外。

　　产酶微生物

　　目前已发现30余种微生物可分泌角蛋白酶，这些微生物主要来自于真菌、放线菌和细菌，如真菌中的皮肤癣菌（Dermatophyte）和白色假丝酵母（Cnadina albicans），放线菌中的链霉菌（Streptomyces），细菌中的地衣芽抱杆菌（Bacillus licheniformis）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）等等。

　　真菌

　　真菌是最早被发现的能够产角蛋白酶的微生物。早在1899年，Ward就报道了Onygena equina（马爪甲团囊菌）能分解角蛋白。许多皮肤真菌类的微生物都有产角蛋白酶的功能，包括须癣毛癣菌（Trichophyton mentagrophytes）、微孢长囊头孢霉菌（Doratomyces microsporus）[12]、红色毛癣菌（Trichophyton rubrum）、鸡禽毛癣菌（Poultries Trichophyton）、石膏样小孢子菌（Microsporum gypseum）、犬小孢子菌（Microsporum canis）和白念珠菌（Monilia albicans）、黄曲霉（Aspergillus flavus）、热带念珠菌（Oidium tropioale）、近平滑念珠菌（Candida parapsilosis）、克柔念珠菌（Candida krusei）等。皮肤真菌附着于皮肤后，首先会利用角蛋白酶将皮肤的角质降解，降解后产生了各种短肽和氨基酸，作为真菌生长的碳源和氮源。然后进一步侵入皮肤进行繁殖、感染，进而形成皮肤病。目前，一些有关致病真菌的研究已经日益展开，同时对角蛋白的降解机理和相关研究也起到了积极的作用。

　　除皮肤真菌外，还有一些其他真菌具有降解角蛋白的功能。Anbu等（2004）发现了一种产角蛋白酶的能力的短尾帚霉（Scopulariopsis brevicaulis），并对这种角蛋白酶进行分离纯化。Singh等研究了21种产角蛋白酶的真菌，发现其中猴发癣菌（Trichophyton simii）降解羽毛角蛋白的能力最强。罗文等从土壤中分离出一株能降解羽毛粉角蛋白的霉菌,初步鉴定为串孢属菌（Catenularia sp.）。Santos报道了分离到降解羽毛角蛋白的烟曲霉（Aspergillus fumigatus），它可以利用羽毛角蛋白作为唯一碳源和氮源生长。

　　放线菌

　　产角蛋白酶的放线菌以链霉菌为主要代表，如弗氏链霉菌（Streptomyces fradia）、黄白链霉菌（Streptomyces alboflavus）K1-02、链霉菌（Streptomyces）DSM 40530和嗜热链霉菌（Streptomyces thermophilus）等。丁正民等（1993）从鸡毛堆肥中分离纯化到一放线菌菌株SS-1，该菌有很强的降解鸡毛的能力[26]。涂国全等（1994）筛选出了角蛋白分解菌株S22-1，该菌能迅速分解羽毛、人发等多种角蛋白。根据该菌的培养特性、形态特征、生理生化特性的测定结果与已知的弗氏链霉菌形态特征、生理生化特性相似，但在培养特性和分解利用羽毛角蛋白的特性上有较大差异，因此被初步鉴定为弗氏链霉菌的一个变种。

　　细菌

　　目前已经筛选和分离到很多能降解角蛋白的细菌，主要为芽孢杆菌。Williamsh等（1989）由家禽羽毛发酵液中富集、分离到了羽毛分解菌，经鉴定为嗜热型地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），这种菌在以羽毛作为其主要的碳氮源的培养基条件下生长最适宜，但不能降解未经高温蒸煮的羽毛。其他芽孢杆菌包括嗜碱芽孢杆菌（Bacillus pseudofirmus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）等。另外具有角蛋白酶活性的细菌还有嗜热厌氧菌、弧菌科细菌（Vibrionaceae）、海岛闪光杆菌、金黄杆菌属等。

　　细菌生长快、易于繁殖、产酶活性高，角蛋白酶最适温度、pH值等性质特异，具有良好的应用潜力。

　　理化性质

　　目前已分离纯化的角蛋白酶的分子量差异较大，从十几kDa到几百kDa不等。较小的为单体酶，有报道来自Nesternkonia spAL-20的角蛋白酶，分子量为18kDa，较大的为复合酶，如嗜热厌氧菌产的角蛋白酶可达200kDa以上。大部分角蛋白酶的分子量集中在30——70kDa之间，如HSIN-HUNG LIN报道的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）产的角蛋白酶大小为30kDa，嗜麦芽黄单胞菌（Xanthomonas maltophilia）产的角蛋白酶大小为36kDa，近平滑念珠菌（Candida parapsilosis）的角蛋白酶为60kDa。枯草芽孢杆菌产角蛋白酶的分子量为60kDa 。

　　底物特异性

　　角蛋白酶作用的底物除了角蛋白外，它还可水解多种蛋白质底物，包括可溶和不可溶的蛋白质。角蛋白酶可以降解如酪蛋白、明胶、牛血清白蛋白等可溶的蛋白质。也可以降解包括羽毛、羊毛、角质、人发、指甲等不可溶的蛋白质。个别角蛋白酶的底物范围很窄，例如鸡毛癣菌角蛋白酶只能降解鸟类羽毛，较难降解其它种类的角蛋白。

　　反应条件

　　角蛋白酶的最适反应pH以中性到碱性居多，一般为7到10之间。个别角蛋白酶最适pH可达到12左右。酸性角蛋白酶比较少，大都为某些真菌，如须毛藓菌产的角蛋白酶最适pH为5.5，白色假丝酵母为4.0。

　　角蛋白酶的最适反应温度一般在40℃——60℃，如Microbacterium的最适温度在55℃，也有温度要求较低或较高的角蛋白酶类，如Stenotrophomonas sp. D1.为20℃，而Fervidobacterium islandicum AW-1的膜结合角蛋白酶的最适温度高达100℃。

　　活性测定方法

　　角蛋白不溶性于水及大部分有机溶剂，使得角蛋白酶活性测定比一般蛋白酶困难。常用测定角蛋白酶的原理是以底物水解后释放的氨基酸的量来确定角蛋白酶的活性。目前测定角蛋白酶的方法主要有三种，一种是直接用角蛋白粉作为底物进行测定，涂国全等（1998）曾以羽毛粉作为测定角蛋白酶的底物[59]。第二种是使用经过修饰的底物进行酶活测定，该方法中作为底物使用的角蛋白被连接上生色基团，通过测定底物水解后放出的生色物质的含量可以判断酶的活性。具有代表性的两种底物是偶氮角蛋白[62]和天青角蛋白[63]，前者将偶氮连接于羽毛角蛋白上的自由氨基酸残基，后者为羊毛角蛋白与三甲基硫堇结合的产物。第三种则是以可溶性的羽毛角蛋白作为底物表征角蛋白酶的活性，该方法由Wawrzkiewicz提出并被广泛采用。它是利用二甲基亚砜溶解羽毛角蛋白，再用异丙醇经行沉淀，干燥后的可溶性角蛋白溶解于相应的缓冲液中作为底物。

　　降解机理

　　微生物降解角蛋白的机理各不相同，因此降解过程中的产物也不尽相同。某些真菌还原双硫键是通过菌丝体表面所分泌的亚硫酸盐及其产生的酸性环境；链霉菌则是通过产生胞内还原酶 然而，不溶于水的角蛋白只能以颗粒的形式存在于胞外。因此，双硫键的还原只能发生在代谢能力强的整体细胞外面，最有可能发生在细胞表面的胞联氧化还原系统(cell—bound redox system)中，它需要不溶的角蛋白与细胞紧密接触。对纯白高温放线菌的观察发现，双硫键还原是通过胞联氧化还原系统进行的。在弗氏链霉菌和地衣芽孢杆菌的角蛋白酶解时，没有检出释放的巯基，这可能是由于胱氨酸双硫键还原产生的半胱氨酸(一SH)很快被转化成了其它产物。

　　角蛋白酶实际上具有二硫键还原酶和多肽水解酶的活性。目前普遍认为角蛋白酶的降解过程分3个步骤，即变性作用、水解作用和转氨基作用。首先二硫键还原酶作用于角蛋白二硫键，将胱氨酸(一S—S一)还原为半胱氨酸(一SH)，使角蛋白高级结构解体而形成变性角蛋白；变性角蛋白在多肽水解酶作用下逐渐水解成多肽、寡肽和游离氨基酸；最后由转氨基作用产生氨气和硫化物而使角蛋白彻底水解。角蛋白中硫主要转化成巯基化合物，硫化氢(HzS)和硫酸盐3种含硫化合物形式存在于分解产物中。通过进一步探索3种含硫化合物的形成过程表明。”，巯基化合物是由角蛋白酶中二硫键还原酶裂解角蛋白中的二硫键而形成的；硫化氢是由含巯基化合物或巯基氨基酸(半胱氨酸)在脱氢氧化酶作用下，脱氢、脱氨基而形硫化氢(H2S)；硫酸盐的形成分别是由H2S或巯基化合物中硫通过氧化酶逐步氧化的结果。

　　应用前景

　　微生物中纯化的角蛋白酶活性很强，可以水解多种难降解的纤维蛋白类，如胶原蛋白、弹性蛋白和角蛋白。因此角蛋白酶具有广泛的应用前景。

　　1、 在农业上，微生物产生的角蛋白酶能使角蛋白降解为多肽和氨基酸，可以用于制造有机肥料，这种有机肥料不仅解决了国内能源紧缺的难题，还降解了污染源，大大改善了环境。在这方面，对于农业资源和畜牧业资源紧缺的中国来说，无疑是一个巨大的资源宝库。

　　2、 在饲料产业中，羽毛等的主要成分是角蛋白，其粗蛋白成分在80%以上，动物必需氨基酸种类齐全，同时含有较多大量元素、微量元素和未知生长因子，是一种良好的、可替代或部分替代鱼粉的饲料蛋白来源。我国平均每年产羽毛达数10万吨，绝大部分未得到合理利用。因此，对废弃羽毛的开发、利用具有重要的应用前景，它一方面解决了当前饲料工业中蛋白资源不足的问题，另一方面又可解决环境污染问题。

　　3、 角蛋白酶还可用于化妆品、工业生产及医药方面。在当今生物处理日益受到关注的形势下，开发有发展潜力的角蛋白降解酶以实现角蛋白的高效生物降解已成为大势所趋。角蛋白酶是皮肤真菌重要的侵袭因子，因此，能否利用角蛋白酶抑制剂或者角蛋白酶单克隆抗体抑制角蛋白酶的作用，削弱皮肤真菌的侵袭性，从而达到治疗皮肤真菌感染的目的，是今后研究角蛋白酶与皮肤真菌感染相互关系的一个重要方向。角蛋白酶具有高效的角蛋白水解活性，利用角蛋白酶改善药物在角蛋白中的通透性，可提高皮肤外用药物的疗效。特别是在银屑病、角化过度性皮肤病( 神经性皮炎、慢性湿疹等) 的治疗应用方面非常值得研究。

　　角蛋白酶也可应用于美容护肤品，帮助活性因子透过皮肤屏障，去除皮肤多余角质，实现皮肤的深层护理。角蛋白酶能水解毛发角蛋白，利用角蛋白酶进行脱毛，治疗多毛症也可能具有良好的应用前景。

　　角蛋白的微生物降解与利用的重大意义，越来越引起了人们的广泛兴趣。然而目前，人们对角蛋白酶的认识还较肤浅。

　　国外一些学者的研究工作，已涉及角蛋白酶高级结构、活性表达分子基础以及酶工程等分子生物学上的研究，主要集中在地衣形芽孢杆菌的角蛋白酶基因，已测出其编码序列。而国内对角蛋白酶的研究还基本停留在产角蛋白酶菌的分离、筛选、角蛋白酶的分离纯化及理化性质的研究，以及角蛋白酶的作用机制的初步研究。而且，研究的对象也极其有限，主要集中于对弗氏链霉菌的研究。而且以胞外酶的研究为主，对胞内酶的发表研究甚少，这主要是因为国内在角蛋白酶的分离提纯上技术上的不完善。而且，丰富毛资源利用率低，在改善透皮药物吸收方面的研究成果欠缺等问题亦急待解决。