双脱氧

取自 食品百科全书

用以确定核酸中核苷酸序列的一个方法。在分离出单链形式的核苷酸之后，使之与DNA杂合，然后与脱氧核苷酸和2′,3′-双脱氧核苷酸的混合物一起在DNA聚合酶的存在下作恒温培养。整个过程利用了DNA聚合酶的两个性质：(1)它能合成单链DNA模板的互补拷贝；(2)它能以2′,3′-双脱氧核苷三磷酸酯为底物。一旦当这一类似物被结合，其3′-端因缺少羟基而不再是链伸长所需的底物，从而使伸长中的DNA链终止。在实际操作中，使用DNA聚合酶I的克伦诺片段(Klenow fragment)，它缺乏完整酶的5′,3′-核酸外切酶的活性。DNA的合成是在有四个脱氧核苷三磷酸酯的存在下进行，其中有一个或几个用32p作了标记，四个反应混合物中的每一个都含有一个双脱氧物。当反应结束时，最终反应混合物的每一个反应物中都有一系列新DNA的片段，都有一个相同的5′-端，但长度各不相同，并以碱基-特定3′-端为终止。这些混合物可用电泳法分离，用放射自显影术(射线显迹法)使之可视化，并读出序列。