细菌L型
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[编辑] 细菌L型又称L型细菌。
细菌细胞壁的肽聚糖结构受到理化或生物因素的直接破坏或合成被抑制，这种细胞壁受损的细菌一般在普通环境中不能耐受菌体内的高渗透压而胀裂死亡。但在高渗环境下，它们仍可存活。 革兰阳性菌细胞壁缺失后， 原生质仅被一层细胞膜包住，称为原生质体（protoplast）；革兰阴性菌肽聚糖层受损后尚有外膜保护，称为原生质球（spheroplast）。这种细胞壁受损的细菌能够生长和分裂者称为细菌细胞壁缺陷型或细菌L型（L form） 。每种细菌都有其固定的形态，其形态决定于细菌最外层的细胞壁，细菌细胞壁不同程度缺失导致细菌变成细菌L型。细菌L型最早由Klieneberger发现，他于1935年从念珠状链杆菌的培养物中发现有一种微小的菌落，当时认为是一种支原体，并命名为L1(以他工作的lister研究所的第一个字母而定)。随后发现其它细菌也能分离出细菌L型，用青霉素、溶菌酶等在体外可诱导细菌L型的产生，并证明细菌L型在无细胞壁的情况下仍能生长繁殖。
细菌L型在体内或体外、人工诱导或自然情况下均可形成，诱发因素很多，如溶菌酶（lysozyme）、溶葡萄球菌素（lysostaphin）、青霉素、胆汁、抗体、补体等。其中溶菌酶和溶葡萄球菌素能裂解肽聚糖中N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β-1,4糖苷键，破坏聚糖骨架。青霉素能与细菌竞争合成肽聚糖过程中所需的转肽酶， 抑制四肽侧链上D-丙氨酸与五肽桥之间的联结，使细菌不能合成完整的肽聚糖。人与动物细胞无细胞壁，也无肽聚糖结构，故溶菌酶和青霉素对人体细胞无破坏作用。
细菌L型的形态因缺失细胞壁呈高度多形性，大小不一，有球形、杆状和丝状等。着色不匀，无论其原为革兰阳性或阴性菌，形成L型大多染成革兰阴性。细菌L型难以培养，其营养要求基本与原菌相似，但需在高渗低琼脂含血清的培养基中生长。细菌L型生长繁殖较原菌缓慢，一般培养2～7天后在软琼脂平板上形成中间较厚、四周较薄的荷包蛋样细小菌落，也有的长成颗粒状或丝状菌落。L型在液体培养基中生长后呈较疏松的絮状颗粒，沉于管底，培养液则澄清。去除诱发因素后，有些L型可回复为原菌，有些则不能回复，其决定因素为L型是否含有残存的肽聚糖作为自身再合成的引物。
某些L型仍有一定的致病力，通常引起慢性感染，如尿路感染、骨髓炎、心内膜炎等，并常在使用作用于细胞壁的抗菌药物（β-内酰胺类抗生素等）治疗过程中发生。临床上遇有症状明显而标本常规细菌培养阴性者，应考虑细菌L型感染的可能性，宜作L型的专门分离培养，并更换抗菌药物。
1 细菌L型的产生
细菌L型是细菌细胞壁部分缺损或完全丧失而造成的。细菌胞壁的缺失可以是自发的，也可以是人工诱导的，但人工诱导的频率远比自发为高。最早发现自发产生细菌L型的细菌是念珠状链杆菌。自发产生细菌L型的机制目前还不十分清楚。Maevskii报道：在节肢动物体内的不同时期，耶尔森氏菌可以改变其形态和超微结构。他用光学显微镜、电子显微镜和培养方法观察了节肢动物体内不同时期的耶尔森氏菌的细胞壁，发现耶尔森氏菌能自发地发生细菌L型转化。
人工方法诱导细菌变为L型细菌的因素较多［3，4，5］，有抗生素如青霉素、先锋霉素、万古霉素、杆菌肽、溶葡萄球菌素；酶类如溶菌酶和脂酶；氨基酸如甘氨酸、蛋氨酸、甲硫氨酸；机体的一些免疫因素如抗体、补体、吞噬细胞；物理因素如紫外线；化学因素如亚硝基胍和去氧胆酸盐等。这些因素根据其作用机理分为4类：一些影响细菌DNA发生改变的因素；直接破坏细胞壁的因素；阻断肽聚糖合成的因素；机体的一些免疫因素。
在不利的环境条件下，细菌转变成细菌L型，这可能是细菌抵抗不利环境条件的一种方式，Zykin对鼠疫耶尔森氏菌L型进行了15年的研究，结果表明：蚤和蜱体内持续存在的鼠疫耶尔森氏菌能转变成细菌L型，并能持续生存几年之久，当这些细菌L型回复成细菌型后，可引起感染。Crowle试验表明：结核杆菌被巨噬细胞吞噬后易变成细菌L型，其原因可能是结核杆菌在抗生素、抗体、补体和溶菌酶等体内因素的作用下，导致细胞壁部分或完全缺失形成细菌L型。
在不少病例中可以看到细菌L型是在治疗过程中分离到的，心内膜炎是最早分离到细菌L型的疾病之一。Schmitt对用青霉素治疗过的心内膜炎患者作细菌分离培养，在101例确诊为细菌性心内膜炎病例中，82例分离到典型的或不典型的L型，其中甲型溶血性链球菌62例、金黄色葡萄球菌16例、大肠埃希氏菌4例。
Domingue［6］对一些曾用过抗生素的慢性泌尿道感染患者进行检查，96%的患者可分离出多形性L型细菌，这些细菌经培养后又可回复成革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌与链球菌。Yamamolo与Homma对10例铜绿假单胞菌感染病例用青霉素治疗，其中4例从患者的尿、脓、痰中分离出L型铜绿假单胞菌。Grape报道：淋病患者用青霉素治疗后，有12%患者可以分离出L型细菌，这些细菌L型对青霉素的耐药比原菌株高，认为这些淋球菌L型的出现可能是由于治疗不当而引起的。
以上病例中，L型细菌的出现都发生在临床用药治疗之后，并且有一定的耐药性，说明用药剂量不足或用药不当是产生细菌L型的重要原因之一［7］。
2 细菌L型的致病性
L型细菌分布非常广泛，凡有细菌的地方皆有L型细菌存在，如土壤、水溪、动物器官及人体组织等。研究证实：病原性微生物的L型仍可保留有一定的毒力，具有致病性。
细菌L型不仅可返祖成为原菌株后具有致病性，某些L菌本身也能致病，Domingue［6］发现L型细菌能引起特发性血尿。L型细菌尤易形成一些慢性感染。已经证实：细菌L型与某些慢性和反复感染有关，如尿路葡萄球菌感染、布鲁氏菌病、沙门氏菌感染、结核病等。从临床材料如脓、血、骨髓、脑脊液、关节滑液、肾盂肾炎患者的尿、肺结核患者的痰、肝病患者的腹水及扁桃体内等都证明有L型存在。细菌L型的致病特征为间质性炎症，与病毒、支原体等无壁微生物引起的感染相似。
敏感动物毒力试验发现：白色念珠菌L型的毒力明显低于原菌株，小鼠静脉注射白色念珠菌L型，生存时间为23.5天，而静脉注射白色念珠菌细菌型，生存时间为15.8天。L菌的致病因素主要是产生一些外毒素如胞外酶和神经毒素及内毒素，有些细菌L型的细胞膜也具有一定的致病性。
L型细菌要发生致病作用，必须首先与人体细胞结合。Jass［8］研究证实：粪肠球菌L型对细胞表面的粘附能力下降，只有其亲代的十分之一，但它仍有一定的粘附能力，能与人体细胞发生粘附，引起致病。Mihailova［9］研究了单核李斯特菌及该菌L型对宿主细胞的粘附作用，用扫描电镜检查显示：L型细菌能持续粘附在巨噬细胞表面达15天之久，而细菌型只能粘附7天。细菌L型一般不侵入细胞内。Ivanova［10］研究表明：化脓性链球菌的细菌型能进入Hela和Pulmo组织培养细胞内，而该菌的L型细菌则不能。
Hurley［11］指出：应该重新评价革兰氏阴性菌内毒素的作用，内毒素并不直接引起败血症，但其释放能作为一个标志，标志该菌发生了L型转化，当细菌变成细菌L型后，有两种结果，一是L菌引起器官衰竭，另外，L菌作为细菌对不利环境的抵抗作用，使细菌能较长时间存活。
细菌及其细菌L型感染与肿瘤发生有关，目前已在人类多种肿瘤细胞中检出细菌L型。认为由于L型细菌缺壁与病毒有相似的生物学特征和致病性，可侵入体细胞内生长繁殖，或进入体细胞内影响宿主细胞DNA复制过程，导致细胞恶变。张世馥在人类多种肿瘤细胞内检出细菌L型。何杰用原位核酸杂交也证实宫颈癌细胞核内有金黄色葡萄球菌L型DNA存在，金黄色葡萄球菌及其L型感染实验小鼠，能诱导小鼠发生恶性肿瘤。Fleisher和Torrey从何杰金氏病患者瘤组织中分离出了细菌L型，并证明细菌L型可致发生急性何杰金氏病，认为细菌L型感染可能和某些病毒的致病机制相似，在肿瘤的发生、发展过程中起一定作用。
许多临床感染病例可以分离到细菌L型，有的病例可以单独分离到细菌L型，也可同时分离出细菌型与细菌L型。这些L型细菌中有的可能仍有一定的致病性，是造成疾病迁延不愈的原因，有的可能失去了致病性，但在体内随时可回复成原菌，又是造成疾病的潜伏与复发的重要原因。
3 细菌L型与免疫
细菌缺失部分或全部细胞壁成分变成细菌L型后，仍具有免疫原性，能刺激机体产生免疫反应，但与其亲代菌产生的免疫反应有所不同。
细菌转变为L型后宿主对L型细菌的体液免疫反应可发生改变。Namba用酶联免疫吸附试验测定了29例眼色素层炎患者及31例其它疾病(风湿、结核、肿瘤)和16例健康对照者血清中化脓性链球菌和金黄色葡萄球菌L型的抗体水平，结果显示：眼色素层炎患者血清中链球菌L型抗体滴度明显低于对照组，而金黄色葡萄球菌L型的抗体水平与对照组比较没有差别。金黄色葡萄球菌L型能产生代谢和生长抑制抗体，并且抑制金黄色葡萄球菌细菌型及细菌L型的生长。
Kita［12］用离子交换色谱、等电聚焦等技术从L型伤寒沙门氏菌菌体中提取了一个细胞毒性蛋白，该蛋白能刺激小鼠巨噬细胞对内毒素反应，产生大量肿瘤坏死因子，提示伤寒沙门氏菌发生L型转化后可影响体液免疫反应，从而导致宿主对伤寒抵抗力的改变。
L型细菌也能激发细胞免疫反应，且细胞免疫反应的能力与L型细菌的定植有关。当L型细菌减少或消失以后，L型细菌产生的免疫也随之降低或消失。在由L型细菌所激发的细胞免疫反应中，由L型细菌克隆的巨噬细胞和L型细菌诱导的细胞毒T细胞均能参与抗细菌免疫。
Kite［13］试验表明：伤寒沙门氏菌L型和伤寒沙门氏菌减毒活疫苗一样，也能在宿主肝细胞内定植，使宿主产生免疫力，而且伤寒沙门氏菌L型刺激宿主机体产生的免疫力比伤寒杆菌减毒活疫苗产生的免疫力持久，因为伤寒沙门氏菌L型细菌在肝细胞内存活时间较减毒活疫苗长，且该免疫力与伤寒沙门氏菌菌体抗原的链长无关。
Nishikawa［14，15］指出：伤寒沙门氏菌L型细菌能刺激机体产生很强的保护作用，能抵抗致死剂量的伤寒沙门氏菌亲代菌的感染，其最小保护剂量为150个L型细菌。伤寒沙门氏菌L型对C3H／HeJ小鼠无毒，能在该小鼠肝和脾内增殖，但增殖极缓慢，在肝内，L型细菌能存活24周之久。这种保护性免疫在免疫4～6周后开始发挥作用［16］。
金黄色葡萄球菌L型能诱导巨噬细胞产生α-肿瘤坏死因子［17］。Matsu用巨噬细胞悬液与金黄色葡萄球菌L型悬液混合，结果金黄色葡萄球菌L型均被杀死。此外，抗α-肿瘤坏死因子能完全抑制巨噬细胞的细胞毒作用。证明该杀灭L型细菌的作用是由α-肿瘤坏死因子作用所产生的。
Ivanova发现：L型大肠埃希氏菌的细胞膜能增加宿主对同种亲代菌株的细胞免疫反应和体液免疫反应能力。Kawashima证实：金黄色葡萄球菌能诱导BALB／C小鼠产生细胞免疫反应。
以上结果显示：有些L型细菌能产生体液免疫反应，有些能产生细胞免疫反应，有些能同时产生体液免疫反应和细胞免疫反应。L型细菌产生的细胞免疫反应主要是由于L型细菌的持续定植。此外细菌胞浆抗原成分也参与L型细菌的免疫反应。
4 L型细菌的耐药性与医院感染
细菌变成L型后与其原菌株不同，故临床治疗用药时，不仅要考虑细菌的药敏，也要考虑L型的药敏。一般认为细菌变为L型后已经失去了细胞壁，而β-内酰胺抗生素(青霉素类抗生素)的作用主要是抑制肽聚糖的合成，所以对细菌L型不起作用，而对作用于核酸与蛋白质合成的药物如红霉素、氯霉素敏感。虽然临床分离出的细菌L型有不同程度的细胞壁缺陷，且常不稳定，但从许多病例分离出的细菌L型对作用于细胞壁的先锋霉素仍显敏感。先锋霉素虽也属β-内酰胺类抗生素，但它对β-内酰胺酶的作用稳定，而且先锋霉素也能作用于微生物的细胞膜，故临床选用先锋霉素大多有效。
临床病例中分离到的细菌型和L型对药物敏感性不同，因此在临床治疗时应同时考虑二者的药物敏感情况，采取联合用药方案，主张应根据所分离到的细菌及L型的药物敏感试验结果来决定用药，主张作用于细胞壁和细胞质的抗生素联合应用，以达到杀菌并阻止其变成细菌L型。
稳定的细菌L型可长期潜伏在机体内，使机体产生特异性抗体，使患者形成慢性病灶，反复发作，如肾炎、风湿性关节炎等。细菌L型能通过胎盘垂直感染胎儿，细菌L型的原生质体同中等大小的病毒相似。细菌L型的致病性，不仅返祖后具存，某些L型细菌本身也能致病。L型细菌可能是某些传染病(如鼠疫、结核病和霍乱等)病原体的一种保存形式，在临床活动中该菌也是一类值得注意的耐药性微生物。
Dorozkova［18，19］发现结核的复发与分枝结核杆菌的L型感染有关。他对2412例结核病例进行了研究，发现214例患者分离出了结核菌L型。进一步研究显示：细菌L型引起的结核病容易复发，表明分离出不稳定的L型是一个重要的预测信号，显示了结核病复发的高度危险性，Glanov调查表明：伴有细菌L型的结核患者症状较重，易于进展，且预后不良。慢性结核病灶内，结核菌以L型为主，且形态多样，有圆球体、巨形体和长丝体等，其形态明显不同于结核菌。由于结核菌L型细胞壁中的抗原成分丢失或减少，其致病性相对减弱，常缺乏明显的临床症状和体征，造成临床误诊。结核菌L型也是结核菌抵抗外界环境和赖以生存的重要形式，细菌L型可在体内长期存活，生长、繁殖，导致结核病缓慢地进展，L型细菌又可大量繁殖，引起L型败血症或回复为结核菌，导致结核病恶化进展。结核菌L型也是重要的传染源之一，故应高度重视结核菌L型的检出。
中耳炎患者分泌物细菌培养大多阴性，培养不出细菌，但该病有强烈的感染指征［20］。Ataoglu采用心脑肉汤和特殊的高渗硫乙醇酸钠肉汤对40例中耳炎患者分泌物进行培养，其中6例在硫乙醇酸钠法有L型细菌生长，而常规培养无细菌生长，因此他认为：经久不愈的慢性中耳炎与细菌L型感染有重要的关系。
由于抗生素的广泛应用等因素，使细菌L型感染增多，细菌L型感染机会的广泛存在，以往由于细菌L型培养未能广泛开展而未被发现。引起感染的L型病原菌以金黄色葡萄球菌为多，其次为化脓性链球菌、表皮葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、枸橼酸杆菌等。L型引起的医院感染多发生于慢性疾病、体质虚弱的患者。患者在非感染性疾病或原发病的基础上继发新的感染，病情较重。尤其金黄色葡萄球菌与鼠伤寒沙门氏菌感染往往病情危重。
细菌L型为细胞壁缺损的变异菌，抗生素广泛应用是诱导细菌L型形成的重要因素。医院感染开始可为普通细菌感染，经抗生素治疗后形成L型，也可开始即为L型感染，造成细菌L型医院感染的因素有：机体抵抗力降低；大量应用广谱抗生素；感染性疾病没有及时治疗；慢性迁延性疾病。引起医院感染的细菌L型抗药性强，治疗困难，根据药物敏感试验结果，合理应用抗生素，同时应用免疫抑制剂及输血或血浆，加强支持疗法。
细菌L型培养的开展与改进，使感染病例培养阳性率明显提高。因此，医院感染科应广泛开展细菌L型培养以提高细菌L型感染的诊断与治疗。
作者单位：第一军医大学珠江医院(广州 510282)
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