蛋白酶k

取自 食品百科全书

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蛋白酶k是一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶，用于生物样品中蛋白质的一般降解。从林伯氏白色念球菌（tritirachium album limber）中纯化得到。该酶有两个ca2+结合位点，它们离酶的活性中心有一定距离，与催化机理并无直接关系。然而，如果从该酶中除去ca2+，由于出现远程的结构变化，催化活性将丧失80%左右，但其剩余活性通常已足以降解在一般情况下污染酸制品的蛋白质。所以，蛋白酶k消化过程中通常加入edta（以抑制依赖于mg2+的核酸酶的作用）。但是，如果要消化对蛋白酶k具有较强耐性的蛋白，如角蛋白一类，则可能需要使用含有1mmol/l ca2+而不含edta的缓冲液。在消化完毕后、纯化核酸前要加入egt（ph8.0）至终浓度为2mmol/l,以鳌合ca2+。

蛋白酶K，是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键。此酶经纯化去除了RNA酶和DNA酶活性。由于蛋白酶K在尿素和SDS中稳定，还具有降解天然蛋白质的能力，因而它应用很广泛，包括制备脉冲电泳的染色体DNA，蛋白质印迹以及去除DNA和RNA制备中的核酸酶。蛋白酶K的一般工作浓度是50—100μg/ml。在较广的pH范围内（pH 4-12.5）均有活性。

来源：源于白色念球菌(Tritirachium album)。

应用：

用于质粒或基因组DNA的分离 RNA的分离 失活RNase, DNase以及反应中的其他酶类 反应条件：蛋白酶K在较广的缓冲液pH范围(pH 4-12.5)、温度范围（37-60℃）、盐浓度（如：3 M GuHCl）或尿素(4 M)条件下均有活性。在一些去污剂如：Tween20(5%)、Triton X-100 (1%)和SDS(1%)条件下也有活性。

比活性：30 units/mg。

分子量：28.9 kDa。

单位定义：在250 μl反应体系，37℃条件下1分钟内能分解释放相当于1 μmol酪氨酸的folin-阳性氨基酸和肽所需要的蛋白酶K的量定义为一个单位(1)。

浓度：20 mg/ml。

贮存条件：20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1 mM CaCl2和50%甘油。贮存于-20℃。保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融，有效保证12月。

推荐反应缓冲液：50mM Tris-HCl (pH7.5),10mM CaCl2 。

孵育温度为55至65℃，理想孵育温度为58℃，孵育时间为15分钟至48小时；理想孵育时间为2小时

值得注意的是，蛋白酶K在原位杂交技术中通常用于杂交前的处理,它具有消化包围靶DNA蛋白质的作用,以增加探针与靶核酸结合的机会,提高杂交信号.但蛋白酶K的浓度过高、消化时间过长或孵育温度过高时,都会对细胞的结构有一定的破坏,导致组织切片的脱落,细胞核的消失,从而影响杂交结果.EDTA缓冲液可以替代蛋白酶K的作用,解决上述出现的问题,并能达到理想的染色效果.

参考文献：1. Anson, M.L. (1939) J. Gen. Physiol. 22, 79.