酶标免疫分析定量测定黄曲霉毒素B1试剂盒使用方法

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-测定的基础是[[抗原抗体反应]]。微孔板包被有黄曲霉毒素B1的[[特异抗体]]。加入标准或样品溶液及黄曲霉毒素B1酶标记物和[[抗体]],游离黄曲霉毒素与黄曲霉毒素酶标记物竞争黄曲霉毒素抗体,同时黄曲霉毒素抗体与[[羊抗体]]连接。没有连接的酶标记物在洗涤步骤中被除去。将基质/[[发色剂]]加入到孔中并且[[孵育]]。结合的酶标记物将红色的基质/发色剂转化为蓝色的产物。加入反应停止液后使颜色由蓝转变为黄色。在450nm处(参比波长大于600nm)测量,吸收光强度与样品中的浓度成反比。+测定的基础是[[抗原抗体反应]]。微孔板包被有黄曲霉毒素B1的特异抗体。加入标准或样品溶液及黄曲霉毒素B1酶标记物和[[抗体]],游离黄曲霉毒素与黄曲霉毒素酶标记物竞争黄曲霉毒素抗体,同时黄曲霉毒素抗体与羊抗体连接。没有连接的酶标记物在洗涤步骤中被除去。将基质/[[发色剂]]加入到孔中并且[[孵育]]。结合的酶标记物将红色的基质/发色剂转化为蓝色的产物。加入反应停止液后使颜色由蓝转变为黄色。在450nm处(参比波长大于600nm)测量,吸收光强度与样品中的浓度成反比。
===4. 提供的试剂=== ===4. 提供的试剂===
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10.2包被有抗体的微孔板条 10.2包被有抗体的微孔板条
-[[锡箔袋]]沿横向压皱外边打开。取出需用数量的微孔板及框架,将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封,保存于2-80C。不要冷冻。+锡箔袋沿横向压皱外边打开。取出需用数量的微孔板及框架,将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封,保存于2-80C。不要冷冻。
10.3标准液 10.3标准液
第188行: 第188行:
所获得的标准和样品吸光度值的平均值除以第一个标准 (0标准) 的吸光度值再乘以100。因此0标准等于100%并且以百分比给出吸光度值。 所获得的标准和样品吸光度值的平均值除以第一个标准 (0标准) 的吸光度值再乘以100。因此0标准等于100%并且以百分比给出吸光度值。
- 标准的吸光度值(或样品)+标准的吸光度值(或样品)
- ----------------------------------x 100= %吸光度值+----------------------------------x 100= %吸光度值
- 0标准的吸光度值+0标准的吸光度值
计算的标准值绘成为一个以黄曲霉毒素B1浓度(ng/kg)的半对数坐标系统曲线图,相对应每一个样品的浓度(ng/kg)可以从标准曲线上读出。 计算的标准值绘成为一个以黄曲霉毒素B1浓度(ng/kg)的半对数坐标系统曲线图,相对应每一个样品的浓度(ng/kg)可以从标准曲线上读出。

当前修订版本

简介

采用竞争酶标免疫法定量测定谷物,饲料及其它食品中的黄曲霉毒素B1。试剂盒中包括了所有检测用的试剂。该试剂盒有96个试验孔包括标准试验,如果进行定量分析,必须有微孔板酶标仪。

目录

[编辑] 1. 用途



Aflatoxin B1采用竞争酶标免疫法定量测定谷物及饲料中的黄曲霉毒素B1。

[编辑] 2. 概要


黄曲霉毒素是主要由黄曲霉 (aspergillus flavus) 寄生曲霉 (a.parasiticus) 产生的次生代谢产物,在湿热地区食品和饲料中出现黄曲霉毒素的机率最高。B1是最危险的致癌物,经常在玉米,花生,棉花种子,一些干果中常能检测到。根据毒力的的大小,EU制订了黄曲霉毒素的限量标准,黄曲霉毒素B1限量2ppb,黄曲霉毒素总量限量4ppb。RIDASCREEN Aflatoxin B1检测试剂盒则能够提供快速而准确的分析。

[编辑] 3. 测定原理



测定的基础是抗原抗体反应。微孔板包被有黄曲霉毒素B1的特异抗体。加入标准或样品溶液及黄曲霉毒素B1酶标记物和抗体,游离黄曲霉毒素与黄曲霉毒素酶标记物竞争黄曲霉毒素抗体,同时黄曲霉毒素抗体与羊抗体连接。没有连接的酶标记物在洗涤步骤中被除去。将基质/发色剂加入到孔中并且孵育。结合的酶标记物将红色的基质/发色剂转化为蓝色的产物。加入反应停止液后使颜色由蓝转变为黄色。在450nm处(参比波长大于600nm)测量,吸收光强度与样品中的浓度成反比。

[编辑] 4. 提供的试剂



每一个盒中的试剂足够进行96个测量(包括标准测定孔),盒中的材料如下:

1 X 96孔板(12条 X 8孔)包被有抗兔IgG的羊抗体

6 X 黄曲霉毒素B1标准液,1.3 ml/瓶,标准液浓度为:0ppb, 1ppb,5ppb,10ppb,20ppb,50ppb


1 X 酶标记的黄曲霉毒素B1溶液(6ml)……………….红色帽

1 X 黄曲霉毒素B1抗体溶液(6ml)…………………....黑色帽

1 X 基质/发色剂(10ml)………………………………….蓝色帽

1 X 反应停止液(14ml)1N硫酸...….………………………黄色帽

1 X 洗涤缓冲液:10mM的磷酸盐缓冲液PH 7.4 包含 0.05% 的吐温-20

注意:由于样品的稀释倍数是10,因此样品中黄曲霉毒素的浓度可以直接从标准曲线上读出。

[编辑] 5. 需要的材料但盒中不提供



5.1设备


---微孔板酶标仪(450nm)定量分析用

---量筒(塑料或玻璃)100ml

---样品提取的玻璃制品:漏斗和50ml的长颈瓶

---粉碎机

---振荡器

---滤纸

---刻度移液管

---50µl,100µl及1000µl和微量加样器

5.2 试剂

---甲醇

---蒸馏水或去离子水


70%甲醇溶液的配制

---取70ml的100%的甲醇

---加入30ml的去离子水或者蒸馏水,振荡充分混匀


[编辑] 6. 操作者应该注意之事项



---标准液含有黄曲霉毒素B1,应特别小心

---使用过的玻璃容器最好用pH7的次氯酸溶液(10%V/V)浸泡过夜

---反应停止液为1N硫酸,避免接触皮肤

---不要使用过了有效日期的试剂盒,稀释或搀杂使用会引起 灵敏度的降低

---不要交换使用不同批号的盒中试剂


[编辑] 7. 储存条件



---保存试剂盒于2-8℃。不要冷冻

---将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封

---标准物质对光敏感,因此要避免直接暴露在光线下

---基质/发色剂对光敏感,因此要避免直接暴露在光线下

[编辑] 8. 试剂变质的迹象



红色的基质/发色剂有任何蓝色表明基质/发色剂变质,应当弃之。

0标准的吸光度值小于0.6个单位 (A450nm<0.6)时,表示试剂可能变质。


[编辑] 9. 样品处理



样品应当保存在阴凉避光之处及冷藏保存

---代表性的样品粉碎后,彻底混均

---称取5g 粉碎后样品于带盖玻璃瓶中,加入25ml 70%的甲醇

---振荡3分钟

---Whatman No. 1滤纸(或相当滤纸)过滤全部样品溶液

---1ml滤液与1ml 蒸馏水混合于螺口盖的离心瓶

---取50ul样品提取液进行分析

注意:如果样品中黄曲酶毒素的浓度比预计的浓度高,样品必须进一步稀释。用35%甲醇(35ml甲醇+65ml水)进一步稀释。

[编辑] 10. 酶标免疫分析程序



10.1测定之前注意事项

1. 用之前将所有试剂回升至室温(20-25℃)。

2. 使用之后立即将所有试剂放回2-8℃。

3. 在使用中不要让微孔干燥。

4. 在EIA分析中的再现性,很大程度上取决于洗板的一致性,仔细按照推荐的洗板顺序操作是EIA测定程序中的要点。

5. 在所有恒温孵育过程中,避免光线照射,用盖子盖住微孔板。

10.2包被有抗体的微孔板条

锡箔袋沿横向压皱外边打开。取出需用数量的微孔板及框架,将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封,保存于2-80C。不要冷冻。

10.3标准液

由于样品的稀释倍数是10,因此样品中黄曲霉毒素的浓度可以直接从标准曲线上读出。

10.4洗涤缓冲液

试剂盒中提供洗涤缓冲液干粉,用1L的蒸馏水溶解,在4℃下准备好的洗涤缓冲液能保存4周。

用100mL的蒸馏水溶解1包洗涤缓冲液干粉,可以得到10X的洗涤缓冲液,在室温(20-25℃)下10X的洗涤缓冲液可以保存8周。取1份10X的洗涤缓冲液,取9份的蒸馏水混合,可配制成直接使用的洗涤缓冲液。

10.5测定程序 (在20-24℃条件下操作)

1. 将足够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架,标准及样品做平行,并记录标准及样品的位置。

2. 加入50ul的标准或处理好的样品到各自的微孔中,每个标准和样品必须使用新的吸头。

3. 加入50ul稀释了的酶标记物(红色盖)到微孔底部。

4. 加入50ul抗体溶液(黑色盖)到每一个微孔底部,小心地使酶标板在平面上做圆周运动以充分混合。在室温下(20℃-25℃)孵育30分钟。

5. 倒出孔中的液体,将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体。用洗瓶或多通道移液器将250ul洗涤缓冲液加入孔中。再次倒出孔中的液体,完全除去孔中的液体,再重复操作洗涤步骤两次以上。

6. 加入 100ul基质/发色剂(蓝色盖)到微孔中,充分混合并在室温(20℃-25℃)暗处孵育15分钟。

7. 加入100ul反应停止液(黄色盖)到微孔中充分混合。混合好在450nm处测量吸光度值,以空气为空白,必须在加入停止液后15分钟内读取光度值。

[编辑] 11. 结果



所获得的标准和样品吸光度值的平均值除以第一个标准 (0标准) 的吸光度值再乘以100。因此0标准等于100%并且以百分比给出吸光度值。

标准的吸光度值(或样品)


x 100= %吸光度值

0标准的吸光度值

计算的标准值绘成为一个以黄曲霉毒素B1浓度(ng/kg)的半对数坐标系统曲线图,相对应每一个样品的浓度(ng/kg)可以从标准曲线上读出。

(曲线省略)

请注意

为了获得样品中的黄曲霉毒素B1的实际浓度(ng/kg),从标准曲线上读出的浓度值。

[编辑] 12. 灵敏度



黄曲酶毒素试剂盒的平均检测下限为1ppb (1µg/kg)。

[编辑] 13. 特异性



RIDASCREEN黄曲霉毒素B1试剂盒的特异性通过对相应的物质进行交叉反应性分析而得到

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